Biochemical, Immunological and Histochemical Study of Cyclosporin-A Induced Gingival Enlargement in Kidney Transplanted Patients

A thesis
Submitted to the College of Dentistry University of Baghdad in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of philosophy in Oral Biology and Histology

By
Khulood A. Al- Safi
B.D.S, M. Sc.

Supervised by
Prof Dr. Athraa Y. Al- Hijazi

دراسة كيمائية حياتية , مناعية وكيميائية نسيجية للتضخم اللثوي المُسبَب بـالسايكلوسبورين لمرضى زرع الكلى

رسالة مُقدَمة إلى
كُلية طب الأسنان – جامِعة بَغداد كجُزء مِن مُتطَلَبات الحُصول على دَرجة فلسفة الدكتوراه في عِلم الأحياء والأنسجة الفموية.

من قِبل
خلود عبد الهادي الصافي
بكالوريوس طب وجراحة الفم و الأسنان
ماجستير امراض و جراحة ما حول الأسنان

بأشراف
أ.د. عذراء يحيى الحجازي

1427 2007

Abstract

Background

Proliferative types of gingival lesions have been found to be associated with the administration of several drugs, namely phenytoin, nifedipine and cyclosporin. Cyclosporin is a potent immunosuppressive agent that used in organ transplantation to prevent allograft rejection. One of major side effects of cyclosporin is gingival enlargement with incidence of approximately 30% in renal transplant patients. The etiology of cyclosporin-induced gingival enlargement is still uncertain till now.

Aim of the Study

The present study was designed to find out any possible correlation between the severity of gingival enlargement with age, sex, daily dosage, and duration of cyclosporin intake. Also to investigate changes in serum and saliva levels of essential elements, enzymes, immunoglobulins and serum C-reactive protein, beside study the alkaline phosphatase enzyme activity of gingival tissue in cyclosporin-induced gingival enlargement, non-enlarged gingiva received cyclosporin, gingivitis patients , and normal healthy individuals.

Methods

The sample population comprised of 120 males and females aged from 17-66 years. This sample was divided into 4 groups, each
one contain 30 subjects :

• Group 1 : cyclosporin-induced gingival enlargement .

• Group 2 : non-enlarged gingiva under cyclosporin treatment .

• Group 3 : plaque-associated gingivitis .

• Group 4 : normal healthy individual .

Serum and saliva samples were collected and then analyzed for estimation essential elements: Zinc (Zn), Copper (Cu), Magnesium (Mg), Calcium (Ca) and Inorganic phosphate (P), by using flame atomic absorption spectrophotometry (AAS). The levels of alkaline phosphatase (ALP) and lactate dehydrogenase (LDH) were analyzed using colorimetric analysis. Immunoglobulins levels in serum and saliva were determined by using single radial immunodiffusion technique. Serum C-reactive protein was analyzed using rapid Latex precipitation technique. Histopathological study with histochemical analysis of the activity of alkaline phosphates enzyme in gingival tissue were done by taking a gingival biopsy.

Results and Discussion

In the present results , the highest percentage of CsA-induced gingival enlargement was seen in males of young age groups. Age and duration of CsA intake had no significant correlation with the severity of gingival enlargement. Daily dosage of CsA therapy had a significant influence on the severity of enlarged gingiva.
The serum and salivary elements (Zn, Mg and P) were significantly reduced (P<0.05) in gingival enlargement group (G1) in comparison to non-enlarged group (G2), gingivitis group (G3) and normal group (G4), where as Cu, Ca and Cu/Zn ratio were

significantly increased.

Calcium and inorganic phosphate are the only essential elements that showed a significant effect in relation to the duration of CsA intake in G1. Only calcium showed a significant influence by sex distribution. Salivary Zn and Cu levels are the only trace elements that presented a statistical significant effect with age.
The serum and salivary ALP and LDH levels exhibited a highly significant elevation (P<0.0001) in G1 if compared to G2, G3 and G4. Serum and saliva ALP and LDH among patients with enlarged gingiva declared a statistically significant effect on sex distribution and duration of drug intake.

An obvious reduction of serum and salivary levels of immunoglobulins (IgA, IgG and IgM) in G1 compared to other groups.
No significant effect (P>0.05) had been found in immunoglobulin levels on the distribution of sex, age and duration of CsA intake in G1.

Patients with CsA- induced gingival enlargement presented the highest percentage of positive results of C-RP.
Histochemical analysis of ALP enzyme activity showed intense stain for ALP activity in all epithelial layers of enlarged gingiva .The highest optical density was recorded in CsA-induced gingival enlargement in basal and spinous layers.

Conclusion :

From these results it can be concluded that a number of markers show promise as sensitive measures of disease prognosis and the effectiveness of therapy. At this time , essential elements, enzymes, immunoglobulins, and C-reactive protein, can be used as a monitor for healthy and patients with different periodontal disease. Saliva may be used alone or as a supplementary to serum tests for confirmation of any finding. Furthermore, analysis of saliva may offers an efforts-effective approach to assessment in controlling progression of periodontal disease in large populations.

الــخـــلاصــــة

الخلفية :
لقد وجد ان الانواع التكاثرية للافة اللثوية مرتبطة بتناول عدة انواع من الادوية مثل (فينوتين / نيفيديبين / و السايكلوسبورين). السايكلوسبورين هو مادة قوية خافضة للمناعة التي تستمعل في زراعة الاعضاء، الغرض منه منع رفض الجسم للعضو المزروع. ان من ابرز الاثار الجانبية لهذا الدواء (السايكلوسبورين) هو تضخم النسيج اللثوي الذي نسبة حدوثه في مرضى زراعة الكلية هو تقريبا 30%. ان سبب حدوث تضخم النسيج اللثوي الذي يسببه السايكلوسبورين ما زال غير معروف لحد الان.

الغرض من الدراسة

تم تصميم هذه الدراسة لايجاد اي علاقة ممكنة بين شدة ا لتضخم اللثوي مع كم من العمر، الجنس، الجرعة اليومية للدواء و مدة دوام اخذ علاج السايكلوسبورين. و كذلك لبحث التغيرات التي تحدث في كل من العناصر الاساسية، الانظيمات و الكلوبينات المناعية (الاجسام المضادة) في المصل و اللعاب و ايضا في بروتينات الطور الحاد. بجانب دراسة فعالية الانظيم (ALP) في النسيج اللثوي في كل من مجموعة المرضى الذين لديهم تضخم لثوي بفعل استعمال دواء السايكلوسبورين، مجموعة المرضى الذين ليس لديهم تضخم لثوي و هم تحت علاج الساياكلوسبورين، و مجموعة المرضى الذين لديهم التهاب اللثة و المجموعة الضابطة للاشخاص الطبيعيين الاصحاء.

الطرق

العينة البشرية تتكون من 120 ذكر و انثى تتراوح اعمارهم من 17-66 سنة. العينة قسمت الى اربعة مجاميع كل مجموعة تحتوي على 30 شخص :

• المجموعة التجريبية الاولى : المرضى الذين لديهم تضخم لثوي بسبب السايكلوسبورين .

• المجموعة التجريبية الثانية : المرضى الذين ليس لديهم تضخم لثوي و هم تحت علاج السايكلوسبورين .

• المجموعة الانظباطية الثالثة : المرضى الذين لديه التهاب اللثة .

• المجموعة الانظباطبية الرابعة : الاشخاص الطبيعيين الاصحاء .

اخذت عينات من المصل و اللعاب و من ثم تم تحليلها لغرض قياس مستويات كل من: العناصر الاساسية (الزنك، النحاس، المغنيسيوم، الكالسيوم، الفوسفات) باستخدام جهاز قياس الضوء الطيفي للامتصاص الذري. قياس مستويات الانظيمات (LDH and ALP) باستخدام المقياس اللوثي. قياس مستويات الكلوبينات المناعية من فئات (IgA, IgG, IgM) بواسطة طريقة مانسيتي (الانتشار المناعي الشعاعي المفرد في الهلام). قياس البروتينات الطور الحاج للالتهابات (C-RP) باستعمال طريقة العصارة (لاتكس) السريعة بالاعتماد على مبدأ التلازن. ثم اخذ عينه من النسيج اللثوي لغرض دراسة فعالية الانظيم (ALP) في النسيج اللثوي.

النتائج

النتائج اظهرت ان اعلى نسبة من التضخم اللثوي كان في الذكور في الفئات العمرية الصغيرة. العمر و مدة دوام استعمال الدواء (السايكلوسبورين) ليس لها اي علاقة احصائية معنوية مع شدة التضخم اللثوي. الجرعة اليومية للدوام اظهرت تاثير معنوي احصائي مع شدة التضخم اللثوي.
العناصر المصلية و اللعابية (الزنك، المغنيسيوم، و الفوسفات) كانت قد اختزلت بشكل ملحوظ احصائيا (P<0.05) عند المرضى الذين يعانون من التضخم اللثوي بالمقارنة مع المجموعة التي ليست لديها تضخم لثوي و مجموعة التهاب اللثة و كذلك مع المجموعة الضابطة الرابعة بينما النحاس و الكالسيوم و نسبة النحاس/الزنك قد اظهرت ازديادا ملحوظا احصائيا.

مستويات الانظيمات (ALP and LDH) اظهرت زيادة معنية عالية جدا (P<0.0001) في المجموعة التجريبية الاولى بالمقارنة مع المجموعة التجريبية الثانية و الثالثة و الرابعة الضابطة. مستويات الانظيمات المصلية و اللعابية للمرضى الذين لديهم تضخم لثوي اظهرت تاثيرا احصائي واضح لكل من الجنس و مدة دوام اخذ العلاج السايكلوسبورين.

انخفاض واضح في مستويات الكلوبينات المناعية في المصل و اللعاب من جميع الفئات (IgA, IgG, IgM) في المجموعة الاولى بالمقارنة مع المجاميع الاخرى التجريبية و الانظباطية.

ليس هناك تاثير معنية (P<0.05) موجود ما بين الكلوبينات المناعية في المصل و اللعاب مع الجنس، العمر، و مدة دوام تناول الدواء في المجموعة التجريبية الاولى و قد وجد ان المرضى الذين لديهم تضخم لثوي عندهم اعلى نسبة من بروتينات الطور الحاد للالتهابات (C-RP) الموجبةز
ان التحيلي النسيج الكيميائي للنسيج المتضخم لثويا اظهر زيادة احصائية معنوية (P>0.05) في الانظيم (ALP) بالمقارنة مع النسيج اللثوي الذي ليس فيه تضخم لثوي و كذلك مع النسيج المأخوذ من التهاب اللثة و النسيج اللثوي الطبيعي.

الاستنتاج

من هذه النتائج نستطيع ان نستنتج ان هنالك مجموعة من المؤشرات التي تظهر بدياة النجاح كقياس حساس للمرض و فعالية العلاج. العناصر الاساسية، الانظيمات، الكلوبينات المناعية و بروتينات الطور الحاد للالتهابات ممكن ان تستعمل كمرشد للسلامة و الصحة للاصحاء و كذلك للمرضى الذين يعانون من مختلف انواع امراض ما حول الاسنان. اللعاب ممكن استعماله وحده او مرتبط مع فحوصات المصل لغرض برهان اي نتائج ممكنه الحصول عليها. و اكثر من هذا تحليل اللعاب من الممكن ان يساهم بشكل فعال لغرض المساهمة في السيطرة على تقدم امراض ما حول الاسنان في مجموعة كبيرة من الناس.